Badania

Wyniki badań

Prowadząc hodowlę koni najistotniejszym z punktu widzenia jakości potomstwa jest dobór klaczy i ogierów do rozpłodu. Ważnym kryterium wyboru pokolenia rodzicielskiego oprócz wnikliwej analizy rodowodowej, wyników prób użytkowych i szeroko pojętej użytkowości jest zdrowie. Zarówno klacze jak i ogiery podczas odchowu podlegają selekcji, a wychów w grupach kształtuje hierarchię.

Jednym z celów realizowanego projektu były obserwacje zachowań samców w grupie, zachodzące między nimi interakcje, budowanie zależności – hierarchia, jak i selekcja pod względem zdolności adaptacyjnych do warunków wychowu zbliżonych do naturalnych. Konie przebywały w grupie maksymalnie długi czas poza budynkiem stajennym na dużym pastwisku z obecnością drzew i krzewów, co umożliwiało im swobodny ruch i interakcje stadne. Bardzo korzystnie wpływało to na dobrostan psychiczny, ogiery były spokojne i z ufnością podchodziły do ludzi. Obserwowano jak radziły sobie z warunkami atmosferycznymi i geograficznymi tego wymagającego miejsca jakim jest położona w terenie podgórskim SK Izby. Konie były karmione wg ogólnie przyjętych norm żywienia koni (Normy Żywienia Koni, PAN Inst. Fizjologii i Żywienia Zwierząt, Warszawa 1994) z uwzględnieniem potrzeb treningowych. Poza obserwacjami behawioralnymi prowadzono wnikliwą analizę parametrów metabolicznych, w szczególności stężenia kortyzolu, melatoniny i innych. Z dostępnych źródeł wynika, że normalizacja tych parametrów powoduje poprawę jakości rogu kopytowego i zapobiega akceleracji wzrostowej.

Prowadzone wielomiesięczne obserwacje ogierów dały cenną informację o ich szeroko pojętych możliwościach adaptacyjnych, nawet przy zwiększonym wysiłku. Jest to o tyle istotne, że obecnie stawiamy naszym koniom coraz większe wymagania, a prowadzona selekcja jest niewystarczająca, o czym świadczy wzrastająca liczba młodych jeszcze nie użytkowanych koni z powikłaniami w obrębie stawów (chipy) i układu kostnego a także oddechowego (RAO). Cały trening ogierów w projekcie został przeprowadzony bez podkuwania przy całkowitym braku kulawizn i problemów ortopedycznych. Bezpieczna możliwość funkcjonowania ogierów bez podków również wpisuje się w poprawę dobrostanu. Ma to również bardzo duże znaczenie dla bezpieczeństwa obsługi.

W pierwszym naborze do badań i treningu przyjęto 16 koni po 8 ogierów rasy wielkopolskiej i małopolskiej. Po kondycyjnym wysiłkowym treningu przeprowadzonym w SK Izby, 12 ogierów zaliczyło zaprzęgową próbę dzielności. W wyniku dalszej oceny bonitacyjnej 10 ogierów uzyskało prawo wpisu do księgi stadnej: 5 ogierów wielkopolskich i 5 ogierów małopolskich.

W drugim naborze do badań i treningu przyjęto 18 młodych ogierów: 4 ogiery wielkopolskie i 14 ogierów małopolskich. Po kondycyjnym wysiłkowym treningu przeprowadzonym w SK Izby do ostatecznej próby komisja wytypowała 12 ogierów: 1 wielkopolskiego i 11 małopolskich ogierów. W wyniku zaliczenia zaprzęgowej próby dzielności i po uzyskaniu pozytywnej oceny bonitacyjnej prawo wpisu do księgi uzyskało 10 ogierów: 1 ogier wielkopolski i 9 ogierów małopolskich.

W trzecim naborze do badań i treningu przyjęto 13 ogierów: 2 ogiery rasy wielkopolskiej i 11 ogierów rasy małopolskiej. Po kondycyjnym wysiłkowym treningu przeprowadzonym w SK Izby, 12 ogierów podeszło do próby dzielności. 6 ogierów zaliczyło zaprzęgowa próbę dzielności oraz uzyskało pozytywną ocenę bonitacyjną co pozwoliło na uzyskanie prawa wpisu do księgi stadnej: 1 ogiera wielkopolskiego i 5 ogierów małopolskich.

Wobec faktu, że obecnie średnia wieku ogierów uczestniczących w programie ochrony w rasie wielkopolskiej to około 20 lat a w rasie małopolskiej około 17 lat oraz że przez ostatnie lata praktycznie nie było młodych ogierów włączanych do programu ochrony pozyskanie 25 młodych ogierów: 7 ogierów wielkopolskich i 18 ogierów małopolskich, do krycia klaczy w rasach zagrożonych uważamy za bardzo duże osiągnięcie realizowanego projektu.

Założenia naukowe badanego modelu treningu stosowane przy pierwszej grupie ogierów potwierdziły swoją skuteczność w drugim jak i w trzecim naborze odchowywanych i  trenowanych ogierów.  Podczas długotrwałej obserwacji w grupie, w warunkach zbliżonych do naturalnych łatwo wyłonić konie, które mają niekorzystne cechy, które uniemożliwiają adaptację do trudnych warunków. Eliminacja z hodowli takich ogierów jest bardzo pożądana. Potwierdza się również teza o utrzymywaniu ogierów w stadzie. Po zbudowaniu hierarchii konie mogą zachowywać się zgodnie z naturalnymi instynktami, co skutkuje brakiem lęku, spokojnym usposobieniem i bezpieczeństwem użytkowania. Dokonano licznych obserwacji naukowych dotyczących rozwoju kończyn i ewolucji kopyt. Podczas badań w ramach projektu zaobserwowano istotny wpływ warunków utrzymania, żywienia zbliżonych do naturalnych na rozwój i jakość koni.

Zalety opracowanej i wdrożonej metody treningu, odchowu i utrzymania koni:

1. Wspólne utrzymywanie wielu ogierów istotnie zmniejsza koszty.
2. Ocena jest obiektywna, ponieważ w rzeczywistości dokonują jej same konie.
3. Konie odchowywane są w naturalnych warunkach prawdziwego dobrostanu ze szczególnym uwzględnieniem dobrostanu psychicznego.
4. Naturalne surowsze warunki spowalniają i harmonizują  proces wzrostu koni zgodny z ich naturalnym rozwojem. W zależności od sezonu następują skoki wzrostowe i okresy ograniczenia wzrostu pozwalające na dostosowanie się organizmu do nowych warunków anatomicznych.
5. Naturalne nierówności terenu pozwalają na wytworzenie „inteligencji ruchowej” oraz ćwiczenie wszystkich części szeroko pojętego aparatu ruchu.
6. Dowiedziono, że utrzymywane w ten sposób konie nawet jako ogiery są niezwykle spokojne, ufne wobec człowieka i bezpieczne w obsłudze.
7. Naturalne warunki oraz niewymuszony ruch sprzyjają prawidłowemu rozwojowi całego organizmu oraz  kopyt co znacznie zmniejsza konieczność ingerencji człowieka i obniża koszt całego procesu.

Podczas realizacji doświadczenia przy określaniu metody treningu, przeprowadzono wiele badań naukowych dotyczących dobrostanu, stresu, rytmu dobowego.  Wykonano pomiary w zakresie układu hormonalnego (testosteron, kortyzol, insulina adiponektyna, gastryna, lektyna, melatonina, dehydroepiandrosteron (DHEA)). Testosteron, kortyzol, DHEA, melatonina były oznaczane rano i wieczorem. Wykazano, że konie które przebywają całą dobę na pastwisku mają wyraźniej zarysowany rytm hormonów niż konie utrzymywane w stajni ze sztucznym światłem. Dotyczy to szczególnie melatoniny i DHEA. Melatonina wydzielana jest podczas zapadania zmroku, a nie po zmroku. W przypadku insuliny wykazano silną korelację jej poziomów a behawiorem. Jeżeli poziom insuliny był poniżej 12 uj/ml to konie były spokojne, nie wykazywały zachowań związanych z lękiem, nie były nadpobudliwe. W celu kontroli funkcji fizjologicznych oraz dobrostanu systematycznie, co 14 dni oznaczane były parametry biochemiczne (glukoza, mocznik, kreatynina, białko ogólne, albuminy, fosfataza zasadowa, transaminazy alaninowa i asparaginianowa, kinaza kreatyninowa) oraz pełna morfologia krwi. 

W trakcie realizacji projektu opracowano metodykę oceny dobrostanu koni w oparciu o badanie parametrów krwi, które świadczą o zdolnościach kompensacyjnych organizmu. Tkanka tłuszczowa jest magazynem energii, która w warunkach deficytu jest uruchamiana. W warunkach fizjologicznych i naturalnych w naszym klimacie tkanka tłuszczowa przynajmniej raz w roku podlega zużyciu. Okresowe deficyty białka skutkują zmniejszeniem poziomów insulinopodobnego czynnika wzrostu i co za tym idzie przerwy we wzroście organizmu konia. Bardzo ważne jest zdiagnozowanie momentu, w którym zdolności kompensacyjne uruchomione przez surowsze warunki środowiska zbliżają się do granicy możliwości. Dla danego osobnika jest to moment, w którym konieczna jest interwencja człowieka, aby jego dobrostan nie został naruszony. W przyrodzie taki osobnik jest eliminowany w sposób naturalny.

Dla obiektywnej oceny warunków minimalnych, w których dobrostan jest zachowany zostały opracowane następujące kryteria:

1. W zakresie parametrów morfologicznych i biochemicznych oznaczanych we krwi, które mogą zostać zaburzone w wyniku trudniejszych warunków środowiskowych wyznaczono minimalne poziomy, które są o 10% wyższe niż dolna granica ich fizjologicznej normy.
   

   Wyznaczone w ramach doświadczenia normy dla badanych parametrów morfologicznych.

   	Parametr	Przedział normy	Przyjęty poziom minimalny.
   1	Hematokryt (%)	35 - 45	38
   2	Liczba erytrocytów (10*12/l)	7 - 12	8,5
   3	Hemoglobina (g/dl)	10 - 18	12
   4	Glukoza (mmol/l)	4,2 – 6,4	4,5
   5	Białko całkowite (g/l)	55 - 75	60

2. W zakresie ilości tkanki tłuszczowej przyjęto obecność tłuszczu zanerkowego na niezmienionym poziomie, zarówno co do wielkości jak i gęstości. Pomiarów dokonywano przy pomocy ultrasonografu. U niektórych osobników dochodzi do zużycia tkanki tłuszczowej podskórnej w okresach podwyższonych wymagań środowiska. Eliminowanie takich koni z powodu fizjologicznego procesu kompensacji byłoby niecelowe. Dlatego oceny dokonywano na podstawie wszystkich badanych parametrów.
3. Ważnym kryterium oceny dobrostanu jest też obserwacja zachowania koni. Przyjęto, że koń musi być aktywny i w pełni uczestniczyć w relacjach stadnych. Jeżeli tak nie jest należy natychmiast rozpoznać przyczynę zmiany aktywności.

W projekcie podczas prowadzenia badań zastosowano najnowsze osiągnięcia genetyki molekularnej stanowiące innowacyjne rozwiązanie zarówno dla samej hodowli jak i gospodarki.
Dla zebranego w ramach projektu materiału badanych koni przeprowadzono genotypowianie w oparciu o dedykowany panel mutacji typu SNP. Analiza obejmowała 240 zmian mutacyjnych dla każdego osobnika. Do analizy SNP-ów na płytkach OpenArray zaprojektowano sondy TaqMan MGB (ThermoFisher Scientific) do dyskryminacji alleli. Projektowanie sond było poprzedzone szczegółową analizą bioinformatyczną sekwencji referencyjnych markerów SNP z GenBanku i Ensembl. DNA wyizolowano z zastosowaniem zestawu Sherlock AX (A&ABiotechnology), a jakość i ilość DNA sprawdzono na spektrofotometrze NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific). Próbki o zbyt dużych stężeniach DNA znormalizowano. Łącznie przeprowadzono analizy dla 512 próbek DNA. Genotypowanie wykonano z zastosowaniem średnio-przepustowego aparatu QuantStudio 12KFlex Real-time PCR System (Applied Biosystems), na bloku OpenArray z wykorzystaniem AccuFill System (automatycznego systemu składania płytek OpenArray). Przeprowadzono analizy jakościowe (QCImage) otrzymanych wyników. Określono genotypy badanych osobników analizując wyniki w ThermoFisher Cloud.

Zastosowany zestaw SNP pozwala na prowadzenie jednocześnie analizy kontroli pochodzenia, struktury populacji (wewnątrz populacji oraz pomiędzy populacjami) oraz identyfikację genetycznego podłoża cech fenotypowych oraz chorób dziedzicznych. W zakresie cech panel SNP uwzględniał markery powiązane z cechami użytkowymi, płcią, umaszczeniem, chorobami dziedzicznymi, behawiorem (GRIN2B, NTM/OPCML), wielkością ciała (LCORL/NCAPG, ZFAT, LASP1, HMGA2), rodzajem chodu (DMRT3), wzrostem mięśni - miostatyna (MSTN), adaptacją do siedlisk (UVSSA, STXBP4, COX11, HLF, MMD) oraz predyspozycją i adaptacją do wysiłku (ACTN3, SLC16A1, PLN, MSTN). Mutacje zostały wytypowane pod kątem identyfikacji nosicieli recesywnych chorób dziedzicznych oraz w aspekcie warunkowania cech fenotypowych istotnych z hodowlanego punktu widzenia dla rasy małopolskiej i wielkopolskiej.

Wszystkie analizy prowadzono w obecności kontroli negatywnej w celu kontroli czystości stosowanych zestawów odczynników. Dla badanego zestawu markerów SNP uzyskano średni call rate około 88% (od 65%-99% dla poszczególnych assay’ów). Niektóre markery były monomorficzne w całej badanej grupie zwierząt (brak zmienności w obrębie badanej populacji). Obliczono MAF (częstość rzadszego allelu) dla wszystkich SNPów. Dla około 75% mutacji częstość rzadszego allelu wyniosła ponad 5% co wskazuje na wysoką użyteczność zastosowanego zestawu do kontroli zmienności genetycznej i analiz populacyjnych. Średni MAF dla sond (z pominięciem sond monomorficznych) był zadowalający i wynosił w przybliżeniu 0,4.
Wyniki analiz posłużą do dalszej oceny struktury genetycznej populacji. Wytypowany zestaw markerów będzie stanowił narzędzie do optymalizacji doboru zwierząt do krzyżowania i świadomej selekcji z uwzględnieniem informacji o ewentualnym nosicielstwie mutacji genetycznych, co jest szczególnie istotne w populacjach małych, gdzie wybór zwierząt chrakteryzujących się pożądanymi cechami i nie spokrewnionych jest bardzo trudny. W przypadku badanych ras – konie małopolskie i wielkopolskie – liczebność populacji zmniejszyła się istotnie w okresie dwóch ostatnich dekad. Z tego względu ocena struktury populacji stanowi cenne narzędzie w strategii hodowlanej tych ras.

Informacja o genotypie zwierzęcia w połączeniu ze standardową oceną pozwala na podjęcie decyzji hodowlanej o zakwalifikowaniu bądź wykluczeniu danego osobnika z hodowli. Dodatkowo, wykorzystanie w selekcji informacji dotyczących posiadania przez zwierzę niekorzystnych wariantów genetycznych związanych z występowaniem chorób dziedzicznych może wpłynąć na spadek częstości ich występowania w populacji. Wykorzystanie nowoczesnego podejścia jakim jest analiza DNA i ocena wartości zwierzęcia poprzez analizę jego potencjału genetycznego stanowi istotne novum w hodowli koni nie tylko w Polsce, ale i za granicą.